Морфологические особенности заживления рубца на матке при использовании метода плазмолифтинга в эксперименте

Р.И. Габидуллина, Э.Р. Гайнутдинова, А.А. Галеев, С.В. Федотов УДК 618.14-001-003.9

Габидуллина Рушанья Исмагиловна – доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии №2 ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, e-mail: ru.gabidullina@yandex.ru

Гайнутдинова Эльвира Рафаиловна – врач гинекологического отделения ГАУЗ ГКБ №7, Казань, 8-937-614-94-95, e-mail: elvlion@rambler.ru

Галеев Азат Альбертович – врач гинекологического отделения ГАУЗ ЦГКБ №18, Казань, 8-987-296-84-46, e-mail: lamantinos@mail.ru

Федотов Сергей Валентинович – заведующий родильным отделением ГАУЗ ГКБ №7, e-mail: NataliyaFedotova1972@mail.ru

Резвяков Павел Николаевич – доцент кафедры нормальной анатомии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, e-mail: rezvyakovp@gmail.com

Певнев Георгий Олегович - Певнев Георгий Олегович, аспирант Казанского (Приволжского) Федерального Университета, e-mail: anatomists@rambler.ru

Реферат. Статья посвящена сравнительной морфологической оценке процесса регенерации тканей матки в области рубца при использовании технологии «Плазмолифтинг» в экспериментальном исследовании на самках кроликов. Технология «Плазмолифтинг» включает местное введение инъекционной формы аутологичной плазмы, обогащенной тромбоцитами, содержащими факторы роста, и включающая цитокины, стимулирующие репаративные и анаболические процессы в поврежденных тканях. В эксперименте участвовало 38 животных, разделенных на контрольную и основную группы, в равных количествах. Животным основной группы область шва на матке обкалывали богатой тромбоцитами плазмой. Забор материала для гистологического исследования производили на 7 и 30 сутки. Морфологическая оценка включала иммуногистохимическое исследование с использованием антител против десмина, альфа-гладкомышечного актина, кальпонина. На 7 сутки послеоперационного периода в тканях матки, обработанных плазмой, обогащенной тромбоцитами, отмечалось более упорядоченное расположение миоцитов, меньшая степень воспалительной реакции, выраженная экспрессия маркеров миометрия при иммуногистохимическом исследовании. На 30 сутки рубец можно было отнести к морфологически состоятельному.

Ключевые слова: богатая тромбоцитами плазма, «Плазмолифтинг», рубец на матке.

MORPHOLOGICAL FEATURES OF UTERUS SCAR HEALING BY USING PLASMOLIFTINGTM METHOD IN EXPERIMENT.

Gabidullina R.I., Gaynutdinova E.R., Galeev A.A., Fedoyov S.V., Rezvyakov P.N. Abstract. The article is dedicated to comparative morphological evaluation of uterus tissues regeneration process in scar region with using plasmolifting technology in experimental research on female rabbit. Plasmolifting technology includes local introduction of injection form of autoplasma, inriched with platelet, containing growth factors and including cytokines that stimulate reparative and anabolic processes in damaged tissues. 38 animals took part in experiment, randomized into control and experimental groups, in equal amount. Uterus seam region in experimental group animals was pricked all round with platelet rich plasma. Taking samples for immunohistochemical research was carried out on 7 and 30 day. Morphological evaluation included immunohistochemical research using antibodies against desmin, calponin, alfa-smooth muscle actin. On 7 day of postoperative period in uterus tissues, processed with platelet rich plasma, we noted more ordered disposition of cellular elements, lesser inflammatory reaction, significant expression of myometrium markers during immunohistochemical research. On 30 day scar could be attributed to be morphologically wealthy.

Key words: platelet rich plasma, plasmolifting, uterus scar.

Одной из важнейших проблем современного акушерства является постоянно возрастающая частота операции кесарева сечения [4, 6]

Кесарево сечение в настоящее время является наиболее распространенной родоразрешающей операцией. Несмотря на стремление акушеров на ведение родов через естественные родовые пути, частота повторных операций у беременных с рубцом на матке остается достаточно высокой [2].

Во многих странах рубец на матке в структуре показаний к кесареву сечению занимает первое место, составляя 15-23% [6, 7].

Рост частоты кесарева сечения не снижает перинатальных потерь, но увеличивает материнскую заболеваемость и смертность [5].

Частота этой операции в России в среднем составляет 15.9%, достигая в перинатальных центрах 30-50%, и не имеет тенденции к снижению [1,5].

В последние десятилетия отмечается тенденция к расширению показаний к абдоминальному родоразрешению [1,5]

Резервом снижения повторного оперативного родоразрешения являются роды через естественные родовые пути. Успех вагинальных родов определяется полноценным рубцом на матке. Поиск современных технологий, способствующих созданию условий для полноценной регенерации тканей в послеоперационной ране, является актуальным [4,7].

Цель работы

Экспериментальное изучение особенностей процесса репаративной регенерации тканей матки в области послеоперационного шва при использовании технологии «Плазмолифтинг».

Материалы и методы.

Эксперимент выполнен на 36 беспородных самках кроликов, массой 1300-1500 г, рандомизированных в контрольную и опытную группы. Наполняемость групп 18 кроликов. В опытной группе в область послеоперационного шва на матке вводилась обогащенная тромбоцитами плазма. Для получения плазмы производился забор крови из краевой вены уха в количестве 5 мл с последующим центрифугированием в течение 10 минут в пробирке с коммерческим названием PlasmoliftingTM. Отличительной особенностью этих пробирок является то, что в них содержится гепарин и уникальный гель, который во время центрифугирования позволяет получить плазму высокой степени очистки, обогащенную тромбоцитами [3].

Под внутривенной анестезией в асептических условиях проводилась срединная лапаротомия и разрез на матке длиной 1 см на каждом роге. Ушивание – одним узловатым викриловым швом через все слои. После ушивания края раны обкалывались аутологичной плазмой в объеме 0.5 мл. Всего производили 6 вколов инсулиновой иглой на расстоянии 2 мм от края раны. В контрольной группе после разреза на матке технология «Плазмолифтинг» не применялся.

Животных выводили из эксперимента на 7 и 30 сутки после операции. Матку забирали на морфологическое исследование. Материал фиксировали в 10 % нейтральном формалине, после чего заливали в парафин. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином, а также проводили иммуногистохимический анализ. Для иммуногистохимического анализа применяли моноклональные антитела против десмина, альфа-гладкомышечного актина (альфа-ГМА), кальпонина и фактора Виллебранда. Для идентификации клеток использовали морфологические критерии. Внутренним положительным контролем служило окрашивание ГМК сосудов в близлежащей ткани. От каждого объекта исследований изучали не менее трех срезов матки на каждый из вышеназванных протеинов.

Эксперимент проводили согласно правилам лабораторной практики РФ (приказ №267 от 19.06.2003 г. МЗ РФ).

Иммуногистохимическое окрашивание проводили с использованием моноклональных коммерческих антител против десмина, альфа-гладкомышечного актина (альфа-ГМА), кальпонина.

Результаты исследования

При морфологическом исследовании в контрольной группена 7 сутки после операции отмечено преобладание соединительной ткани над миогенной (рис. 1). При иммуногистохимическом окрашивании препаратов антителами против альфа-ГМА, десмина и кальпонина отмечена высокая степень экспрессии всех трех белков в пучках ГМК «выжившего» миометрия, вместе с тем менее выраженная по сравнению с опытной группой. ГМК рядом расположенных сосудов имели высокий уровень экспрессии десмина, альфа-ГМА и кальпонина, по которому они не отличались от «выживших» миоцитов области рубца на матке.

Вокруг миоцитов видны многочисленные веретенообразные фибробластоподобные клетки, миогенное происхождение которых подтверждает тот факт, что они экспрессируют десмин, альфа-ГМА и кальпонин. Но уровень экспрессии этих протеинов был значительно ниже, чем в «выживших» миоцитах, что заметно при их сравнении с близрасположенными пучками ГМК и сосудов.

Таким образом, на 7 сутки после операции миометрий области шва представлен своеобразным микстом из рыхлой соединительной ткани, миогенных фибробластоподобных клеток, пучков «выжившего» дефинитивного миометрия и клеток воспаления. При этом для опытной группы характерна меньшая выраженность воспалительной реакции и более упорядоченное расположение клеточных элементов миометрия и выраженная экспрессия маркеров ГМК. Индекс гистологической зрелости от 3 до 5 баллов.

Через 30 дней в контрольной группе после операции в препаратах миометрия была обнаружена как плотная грубоволокнистая соединительная ткань, так и ГМК. Разнонаправленные волокна миоцитов окружены соединительной тканью, в которой как прослойка присутствуют тяжи единичных мышечных клеток. Отмечается более упорядоченное строение миометрия в области рубца по сравнению с 7 сутками после операции (рис. 2).

При окраске антителами против десмина, альфа-ГМА и кальпонина отмечено, что, во-первых, не все миоциты одинаково интенсивно экспрессируют протеины миогенной дифференцировки, во-вторых, их экспрессия в части миоцитов слабее уровня экспрессии в ГМК близлежащих сосудов (рис. 3). Данное наблюдение позволяет предположить, что по функциональному состоянию ГМК имеют различную степень дифференцировки. Некоторые из них относятся к функционально зрелым, так как имеют высокий уровень экспрессии всех трех исследуемых протеинов. Другие имеют низкий уровень экспрессии вышеназванных протеинов, что позволяет отнести их к группе вновь образованных, созревающих миоцитов. Это происходит в результате того, что наряду со старыми, «выжившими» после операции высокодифференцированными клетками, происходит созревание молодых, вновь образованных в области рубца миоцитов, которые ещё находятся в процессе дифференцировки. Индекс гистологической зрелости составляет 6-7 баллов.

При морфологическом исследовании тканей матки на 7 сутки в опытной группе отмечено упорядоченное расположение клеточных элементов миометрия, между которыми располагались волокна хорошо организованной соединительной ткани (рис. 4). Ткань миометрия из области рубца имела вид «сэндвича», определялась выраженная экспрессия маркеров ГМК. При обработке ткани из области рубца антителами против десмина, альфа-ГМА и кальпонина отмечена неоднородная окраска миоцитов (рис. 5). Миометрий был представлен «выжившими» мышечными пучками зрелых ГМК и созревающими миогенными элементами. Среди волокон с яркой окраской видны бледно окрашенные мышечные клетки. ИГЗ никогда не опускался ниже 4, и в среднем составил более 5 баллов (от 4-6 баллов).

Через 30 дней после операции в гистологической картине опытных образцов препаратов ткани матки из области рубца увеличилось количество ГМК. Экспрессия альфа-ГМА и десмина находилась на высоком уровне. В препаратах значительно увеличилось количество экспрессирующих кальпонин миоцитов (рис. 6), при этом их гетерогенность по яркости окраски снизилась. Среди хорошо окрашенных кальпонин-позитивных миоцитов видны единичные бледно окрашенные кальпонин-позитивные ГМК. Этот рубец можно отнести к морфологически сформированному. Индекс гистологической зрелости составляет 7-8 баллов.

Обсуждение

В работе изучалась в экспериментальных условиях возможность применения технологии «Плазмолифтинг» для создания полноценного рубца на матке. В качестве нового и безопасного биологического стимулятора, действующего на всю цепочку регенерации тканей, Р.Р. Ахмеровым и Р.Ф. Зарудием было предложено местное введение инъекционной формы богатой тромбоцитами аутологичной плазмы (БоТП). Получение БоТП включает создание максимальной концентрации тромбоцитов, содержащих факторы роста. Аутологичная плазма не является токсичной и тромбогенной [3]. Тромбоциты содержат в высоких концентрациях ростовые факторы, такие как тромбоцитарный фактор роста (PDGF), трансформирующий фактор роста (TGF-1) фактор роста эпителия (EGF), фактор роста эндотелия сосудов (VEGF). Эти факторы способны стимулировать клеточную пролиферацию и ангиогенез [9]. Однако применение БоТП не вызывает гиперпластических процессов, канцерогенеза или роста опухолей, так как факторы роста влияют на рецепторы, расположенные в клеточной мембране, а не в ядре клетки. Вторичные посредники факторов роста инициируют нормальную экспрессию генов, а не патологическую, которая лежит в основе развития опухолей. К дополнительным эффектам следует отнести содержание в БоТП цитокинов, стимулирующих репаративные и анаболические процессы в поврежденных тканях [11].

Морфологическая оценка процесса репарации включала иммуногистохимическое исследование с использованием антител против десмина, альфа-гладкомышечного актина (альфа-ГМА), кальпонина. Известно, что все клетки миогенной линии экспрессируют десмин, поэтому он выбран нами в качестве индикатора миогенных клеток. По уровню экспрессии специфических белков выделяют два фенотипа гладкомышечной мускулатуры (ГМК): сократительный (функционально зрелый) и синтетический (функционально незрелый, созревающий или покоящийся) [8]. Гладкомышечные клетки в синтетической фазе имеют низкий уровень синтеза контрактильных белков: альфа-ГМА, кальпонина, десмина [14]. Стадия дифференцировки мышц наоборот отличается повышением синтеза данных белков [12]. Эти белки уникальны и характерны только для зрелых (контрактильных) ГМК и отсутствуют в незрелых миоцитах синтетического типа [13]. Кальпонин также экспрессируется в зрелых ГМК, имеющих сократительный фенотип [10].

Морфологическую картину миометрия кролика в области интраоперационного повреждения в независимости от экспериментальной группы исследовали по ранговой системе оценки морфологической структуры и интенсивности экспрессии протеинов, разработанной доц. кафедры нормальной анатомии Казанского ГМУ Резвяковым П.Н. Использованный метод определения позволяет оценить как каждый из морфологических показателей в отдельности, так и весь процесс созревания гладкомышечной ткани в совокупности. Общая сумма баллов отражает степень зрелости гладкомышечной ткани женской репродуктивной системы в целом.

Индекс гистологической зрелости (ИГЗ) гладкомышечных клеток матки кролика

Морфологические показатели

Баллы

1. Структура мышечной ткани матки

А. В гистологическом препарате только соединительнотканные элементы, нет миогенных клеток

Б. Абсолютное преобладание соединительнотканных элементов над ГМК

В. Паритет соединительнотканных элементов и миоцитов. ГМК располагаются правильными пучками, между ними в виде прослойки соединительнотканные волокна, их соотношение 50/50

Г. Преобладание ГМК над соединительнотканными элементами

Д. Гистологическая картина нормального мышечного слоя матки

2. Экспрессия определяемого протеина в ГМК матки

А. Нет в ГМК матки, только в ГМК рядом расположенных сосудов

Б. В миоцитах рядом расположенных сосудов и в единичных ГМК матки

В. Как «Б» + в большинстве ГМК матки

Г. Как «Б» + во всех ГМК матки

3. Интенсивность окрашивания ГМК матки

А. Нет

Б. Слабая

В. Умеренная

Г. Выраженная

Максимальная сумма баллов

В связи с невозможностью адекватной оценки числа миоцитов гладкомышечных клеток матки при оценке иммуногистохимического окрашивания антителами против альфа-ГМА, десмина и кальпонина была использована балльная градация выраженности экспрессии данного маркера:

0 баллов - соединительная ткань, иммуноэкспрессия исследуемого маркера только в ГМК расположенных рядом сосудов;

3 балла - незрелая гладкомышечная ткань, иммуноэкспрессия исследуемого протеина в единичных ГМК матки, абсолютное преобладание соединительной ткани над гладкомышечной;

4 - 7 баллов - созревающая гладкомышечная ткань, иммуноэкспрессия исследуемого протеина в большинстве ГМК матки, причем отмечается неоднородность окраски ГМК на исследуемый протеин (одни ГМК окрашены ярче, чем другие), равенство или незначительное преобладание гладких миоцитов над соединительной тканью;

8-10 баллов - морфологически зрелая гладкомышечная ткань, высокая (яркая) иммуноэкспрессия исследуемого протеина во все ГМК матки и по морфологическим и иммуногистохимическим признакам он не отличается от интактного миометрия кролика.

Результаты проведенных исследований позволили выявить преимущество применения технологии «Плазмолифтинг». При иммуногистохимическом исследовании на 7 сутки при использовании обогащенной тромбоцитами плазмы отмечено упорядоченное расположение клеточных элементов миометрия и волокон соединительной ткани.

На 30 сутки рубец можно было отнести к морфологически сформированному, тогда как в контрольной группе выявлялись созревающие молодые миоциты, находящиеся в процессе дифференцировки. Соотношение миометрия к соединительной ткани было более выраженным по данным исследования в опытной группе.

Литература

1. Абрамченко В.В., Ланцев Е.А., Шахманова И.А./ Кесарево сечение в перинатальной медицине – Санкт-Петербург – 2005 – С.206

2. Айламазян Э.К./ Акушерство – Санкт-Петербург – 2006.

3. Ахмеров Р.Р., Зарудий Р.Ф. и соавт./ Аутостимуляция регенеративных процессов при лечении атрофических состояний кожи и ее придатков. Пособие для врачей – М. – 2011 – С. 5-8.

4. Болотова О.В./ Акушерство и гинекология – 2009 - №5 – С.7

5.Краснопольский В.И., Логутова Л.С., Буянова С.Н./ Репродуктивные проблемы оперированной матки – М. – 2005 – С.160

6. Савельева Г.М./ акушерство и гинекология - 2008 - №3 – С.10

5. Савельева Г.М., Караганова Е.Я., Курцер М.А./ Акушерство и гинекология – 2008 - №2 – С. 3-8

6. Савельева Г.М., Курцер М.А., Клименко Н.А. и соавт./ Акушерство и гинекология – 2005 - №3 – С. 3-7

7. Чернуха Е.А./ Акушерство и гинекология – 2005 - №5 –С. 8-12

8. Bochaton-Piallat M.L. Phenotypic heterogeneity of rat arterial smooth muscle cell clones: implications of the development of experimental intimal thickening / M.L. Bochaton-Piallat, P. Ropraz, F. Gabbiani, G. Gabbiani // Arteriosclerosis Thrombosis Vascular Biology, 1996. - V. 16. –P. 815-820

9. Frechette J.P., Martineau I., Gagnon G./ Platelet rich plasmas: grouth factor content and roles in wound healing/ J Dent Res. – 2005 – 84:434 – 9

10.Kilarski W.M. Effect of progesterone and oestradiol on expression of connexin43 in cultured human myometrium cells / W. M. Kilarski, J. Hongpaisan, D. Semik, G. M. Roomans// Folia Histochem. Cytobiol., 2000. - V. 38 (1). - P. 3-9.

11. Marx, R. Dental and craniofacial applications of platelet-rich plasma / R.Marx, A. Garg. – Carol Stream: Quintessence Publishing Co, Inc., - 2005 – P. 221

16. - P. 815-820

12.Merlie J. P. Molecular aspects of myogenesis / J. P. Merlie, M. Buckingham, R. G. Whalen // Curr. Top. Dev. Biol., 1977. - V. 11. - P. 61.

13. Skalli O. Cytoskeletal remodeling of rat aortic smooth muscle cells in vitro: relationships to culture conditions and analogies to in vivo situations / O.Skalli, W.S. Bloom, P. Ropraz et al. // J. Submicrosc. Cytol., 1986. - Vol. 18 (3). - P. 481-493

14. Worth N.F. Vascular smooth muscle cell phenotypic modulation in culture is associated with reorganisation of contractile and cytoskeletal proteins / N.F. Worth, B.E. Roife, J. Song, G.R. Campbell // Cell. Motil. Cytoskeleton, 2001. - V. 49 (3). - P. l30-145.

Авторы статьи:

Габидуллина Рушанья Исмагиловна – доктор медицинских наук, профессор кафедры акушерства и гинекологии №2 ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, Казань, e-mail: ru.gabidullina@yandex.ru

Галеев Азат Альбертович – врач гинекологического отделения ГАУЗ ЦГКБ №18, Казань, 8-987-296-84-46, e-mail: lamantinos@mail.ru

Федотов Сергей Валентинович – заведующий родильным отделением ГАУЗ ГКБ №7, Казань, e-mail: NataliyaFedotova1972@mail.ru

Резвяков Павел Николаевич – доцент кафедры нормальной анатомии ГОУ ВПО КГМУ Росздрава, Казань, e-mail: rezvyakovp@gmail.com

< Назад